Séquençage à « longues lectures SMRT »
Basé sur la technologie SMRT (Single Molecule Real Time), le séquençage sur les plateformes PacBio (notamment les systèmes Revio et Vega) permet de produire de très longues lectures à très haute précision. Cette approche est idéale pour résoudre les régions de faible complexité (régions répétées, hétérochromatine), caractériser l’ensemble des variants structuraux, assembler des génomes de novo et déterminer les haplotypes de manière intégrale.
Une banque SMRT type est construite à partir de fragments d’ADN double brin. Après réparation des extrémités, des adaptateurs simple brin y sont ligaturés pour former une structure en boucle fermée (SMRTbell), servant de point d’ancrage pour la DNA polymérase et permettant une lecture circulaire (Figure 1).
Le complexe insert–adaptateur–polymérase est déposé et immobilisé au fond de millions de puits nanométriques appelés ZMW (Zero-Mode Waveguides). Chaque ZMW permet la détection en temps réel du signal fluorescent émis lors de l’incorporation des nucléotides par la polymérase (Figure 2).
La technologie repose désormais majoritairement sur le mode HiFi (High-Fidelity), basé sur le séquençage par consensus circulaire (CCS : Circular Consensus Sequencing). La polymérase parcourt plusieurs fois la même molécule SMRTbell circularisée : Mode HiFi (Standard actuel) : La répétition des passages sur un même fragment (généralement de 15 à 20 kb) permet de corriger les erreurs aléatoires et d’obtenir des lectures consensus individuelles d’une précision supérieure à 99,9 % (Q30+), rivalisant avec le séquençage à courtes lectures tout en conservant la longueur.
Innovations récentes : Débit et échelle : L’introduction des puces SMRT Cell 25M (sur le système Revio) a multiplié par près de 3 le nombre de ZMWs par rapport au Sequel IIe, réduisant drastiquement les coûts et le temps d’acquisition par génome.
- Épigénétique intégrée : La mesure des cinétiques d’incorporation de la polymérase permet aujourd’hui d’identifier directement les modifications de bases (ex. 5mC, 5hmC) simultanément au séquençage des bases, sans traitement chimique préalable (comme le bisulfite).
- Analyse embarquée : La conversion des données brutes en séquences HiFi à haute précision est désormais réalisée directement en temps réel par les processeurs embarqués des séquenceurs.
