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Séquençage du transcriptome

Grâce aux nouvelles technologies de séquençage, l’étude de l’ensemble des transcrits (transcriptome) présents dans un échantillon biologique est devenue une partie intégrante des approches en génomique fonctionnelle. L’ARNseq permet non seulement de réaliser un catalogue de gènes exprimés mais aussi de quantifier l’expression des gènes et de déterminer la structure de chaque transcrit. Les données ARNseq sont aussi utilisées pour l’annotation des génomes de novo. Dû à sa haute résolution, l’analyse du transcriptome permet d’identifier des sites d’initiation de la traduction ou d’épissages alternatifs.

Actuellement, le panel des kits disponibles pour la préparation d’échantillons pour l’ARNseq est très large permettant l’analyse du transcriptome d’organismes eucaryotes et procaryotes. Afin d’obtenir une information fiable et de qualité à partir d’une expérience ARNseq, il est crucial de pouvoir atteindre un taux de couverture suffisant pour la détection du plus grand nombre de transcrits, même les moins exprimés. Pour cela, une étape préliminaire d’enrichissement des transcrits autres que les ARNt et ARNr peut être nécessaire. C’est le cas par exemple du protocole du kit TruSeq Illumina basé sur la fragmentation des ARNs par la chaleur en amont de la synthèse des cDNA par random priming. Dans ce cas, une sélection d’ARN polyadenilés ou une déplétion des ARNs ribosomaux est effectuée en amont de cette étape, selon qu’il s’agisse d’une étude sur des espèces eucaryotes ou procaryotes. D’autres kits présents sur le marché sont plutôt basés sur une synthèse par oligodT priming (comme le kit SMARTer de Clontech, limité donc aux études des ARNs polyadenilés) ou sur un set de primers sélectifs utilisés pour une synthèse favorisant les ARNs messagers (Nugen). Une fois synthetisés, les cDNA sont soumis à la préparation d’une banque Illumina standard pour du séquençage en single ou en paired end. (Fig. 1).

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Certains kit donnent la possibilité de préparer des librairies pour le ARNseq directionnel, permettant d’identifier le brin codant le ARNm. Cette information est très précieuse pour l’annotation du transcriptome, et pour l’identification de différentes isoformes.

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